生物除磷為去除城鎮(zhèn)污水中磷的重要方法，也是保護(hù)地表水環(huán)境、減輕或避免水體富營養(yǎng)化的重要技術(shù)措施近年來，有研究認(rèn)為生物除磷不僅與聚磷菌(PAOs)有關(guān)，而且可能與生物絮體中的胞外聚合物(EPS)有密切聯(lián)系.例如，Cloete等和方振東等檢測到EPS中含有大量磷，認(rèn)為EPS是污泥絮體重要的磷貯存庫;研究認(rèn)為，EPS磷含量的變化為厭氧減小、好氧增大，且SRT越大，EPS磷含量越大，EPS除磷量越大;韓瑋等則研究認(rèn)為，厭氧/好氧反應(yīng)過程中EPS含磷量呈波浪形變化，EPS在生物除磷過程中主要起緩沖作用，是胞內(nèi)聚磷合成的中轉(zhuǎn)站;研究發(fā)現(xiàn)，不同SRT下EPS含量沒有明顯變化，但EPS的磷含量隨SRT的增大而增大.上述結(jié)果說明，EPS對生物除磷過程有重要影響，但其在生物除磷中的確切作用還不清楚.

　　有研究人員采用STS法(化學(xué)分級)和31P-NMR檢測到細(xì)胞膜外或EPS中存在聚磷酸鹽(Poly-P)，說明EPS參與了生物聚磷過程.Hill等(檢測到以葡萄糖為部分碳源的SBR反應(yīng)器活性污泥好氧吸磷形成的部分Poly-P位于細(xì)胞膜外.Jing等對該反應(yīng)器進(jìn)行了后續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜外的Poly-P與金屬陽離子結(jié)合/絡(luò)合.隨著對生物絮體結(jié)構(gòu)認(rèn)識的深入，研究人員意識到上述現(xiàn)象與EPS有密切聯(lián)系.張志超等觀察到普通活性污泥EPS磷的主要形態(tài)為正磷酸鹽(PO3-4-P)，而生物強化除磷污泥EPS磷的主要形態(tài)為Poly-P.然而，上述研究僅對細(xì)胞膜外或EPS中磷酸鹽的形態(tài)進(jìn)行了分析檢測，未深入研究生物除磷過程中EPS不同形態(tài)磷酸鹽(包括正磷酸鹽、低分子量聚磷酸鹽和高分子量聚磷酸鹽)含量的動態(tài)變化.

　　為此，本文以兩組不同SRT的實驗室A/O-SBR反應(yīng)器活性污泥為研究對象，采用STS法研究不同SRT和溶解氧(DO)下EPS磷酸鹽含量的動態(tài)變化，深入剖析EPS磷酸鹽形態(tài)對生物除磷過程的影響，以期為進(jìn)一步明確EPS在生物除磷中的作用提供一定的科學(xué)依據(jù).

　　2 材料與方法

　　2.1 活性污泥的來源

　　以兩組實驗室A/O-SBR反應(yīng)器的活性污泥為研究對象，將SRT分別控制在10 d和30 d;其中，SRT為10 d的反應(yīng)器記為1#，SRT為30 d的反應(yīng)器記為2#.反應(yīng)器采用瞬時進(jìn)水，運行周期為12 h，其中，厭氧運行4 h，好氧運行7 h，沉降50 min，排水和閑置10 min.反應(yīng)器進(jìn)水采用人工配水，其COD ∶ N ∶ P為50 ∶ 5 ∶ 1;采用葡萄糖、淀粉、乙酸鈉、丙酸鈉和蛋白胨為復(fù)合碳源，KH2PO4為磷源，蛋白胨和NH4Cl為氮源，并投加適量微量元素.兩組不同SRT的A/O-SBR反應(yīng)器好氧反應(yīng)結(jié)束前的DO濃度先后控制為0.7~1.0 mg · L-1和2.5~3.5 mg · L-1，分別代表DO受限(簡稱低DO)和DO適中(簡稱中DO)條件;低DO條件厭氧階段初始時刻混合液的ORP為-200~-220 mV，中DO條件厭氧階段初始時刻混合液的ORP為-40~-70 mV，通過DO條件短暫改變(約為3 d)考察DO對污泥絮體磷形態(tài)和分布、EPS磷酸鹽形態(tài)及其動態(tài)變化的影響.

　　2.2 分析測量方法

　　取一定體積的活性污泥樣品于4500 r · min-1下離心15 min，離心上清液經(jīng)0.25 μm濾膜過濾，測量過濾液總磷(TP)和正磷酸鹽(PO3-4-P)含量.向離心沉淀物補充4 ℃超純水使污泥重新懸浮，其體積為40 mL，污泥濃度約為8000 mg · L-1(以VSS計).然后，采用超聲波-樹脂法提取EPS，提取EPS后的污泥顆粒視為細(xì)菌細(xì)胞.TP含量測定時采用封閉回流消解法預(yù)處理，其中，污泥中TP含量測定時需先將離心清洗后的污泥懸浮液進(jìn)行超聲波分散，用鉬銻抗法測定TP和PO3-4-P含量.將部分污泥懸浮液和細(xì)菌細(xì)胞懸浮液于-50 ℃下真空冷凍干燥48 h，稱取15~20 mg凍干樣品，測量污泥和細(xì)菌細(xì)胞中不同形態(tài)磷的含量，并利用差減法計算EPS中不同形態(tài)磷的含量.DNA采用二苯胺法測定.

　　污泥和細(xì)菌細(xì)胞中不同形態(tài)磷含量的測定采用改進(jìn)的STS法，具體測量步驟見圖 1.該法將樣品中的磷分為正磷酸鹽(PO3-4-P)、低分子量聚磷酸鹽(LMW Poly-P)、磷脂(Lipid-P)、DNA磷(DNA-P)、高分子量聚磷酸鹽(HMW Poly-P)、蛋白質(zhì)磷和殘渣磷(Protein+Residue-P).混合離心提取液中TP含量測定時采用封閉回流消解法預(yù)處理，用鉬銻抗法測定TP和PO3-4-P含量，DNA-P含量由DNA含量乘以系數(shù)9.2%計算得到(磷是DNA的特征元素，含量相對恒定)，差減計算得到LMW Poly-P和HMW Poly-P含量.

　　圖 1 改進(jìn)的STS法基本步驟

　　3 試驗結(jié)果

　　3.1 SRT和DO對主體液相磷濃度變化的影響

　　由圖 2可以看出，不同SRT和DO條件下反應(yīng)器主體液相磷濃度的變化均表現(xiàn)為厭氧升高、好氧降低，說明兩組A/O-SBR系統(tǒng)具有良好的生物強化除磷(EBPR)性能，聚磷菌(PAOs)獲得生長競爭優(yōu)勢.反應(yīng)器進(jìn)水磷源為KH2PO4，反應(yīng)過程中液相的PO3-4-P濃度占TP濃度的95%以上，說明污泥絮體厭氧釋放和好氧吸收的磷主要為PO3-4-P.

　　圖 2 運行周期中反應(yīng)器主體液相磷濃度的變化

　　SRT為10 d時，中DO條件下1#反應(yīng)器液相TP濃度的厭氧升高量和好氧降低量明顯大于低DO條件，且液相TP濃度在厭氧初期(0~1 h)和好氧初期(4~5 h)有更大的變化速率;同時，中DO條件和低DO條件下液相TP濃度在好氧反應(yīng)結(jié)束前分別為0.81 mg · L-1和5.65 mg · L-1，進(jìn)水TP去除率分別為95.95%和71.75%.然而，SRT為30 d時，DO對2#反應(yīng)器液相TP濃度的厭氧升高量和好氧降低量影響較小;同時，中DO條件和低DO條件下液相TP濃度在好氧反應(yīng)結(jié)束前分別為3.63 mg · L-1和3.86 mg · L-1，進(jìn)水TP去除率分別為81.85%和80.70%.上述結(jié)果說明，DO濃度的變化對中SRT(10 d)污泥系統(tǒng)的生物除磷過程及效果影響較大，而對高SRT(30 d)污泥系統(tǒng)的生物除磷過程及效果影響較小.這是因為高SRT污泥較中SRT污泥絮體的結(jié)構(gòu)更為密實，前者絮體的微觀生化環(huán)境受DO濃度變化的影響小于后者，進(jìn)而導(dǎo)致DO條件改變對高SRT污泥系統(tǒng)的生物除磷過程及效果影響較小.

　　3.2 SRT和DO對污泥絮體磷形態(tài)的影響

　　由表 1可知，SRT為10 d污泥的TP含量在低DO和中DO條件下分別為21.68~28.53 mg · g-1(以SS計，下同)和23.01~35.85 mg · g-1，而SRT為30 d污泥的TP含量在低DO和中DO條件下分別為30.39~37.13 mg · g-1和34.65~43.40 mg · g-1.上述結(jié)果表明，高SRT(30 d)污泥的磷含量明顯高于中SRT(10 d)污泥，且中DO條件的污泥較低DO條件的污泥有更高的磷含量.

　　表1 不同SRT和DO條件下活性污泥的TP含量

　　由圖 3可以看出，污泥絮體中的磷主要以PO3-4-P和Poly-P的形態(tài)存在，分別為污泥TP含量的15.53%~44.91%和31.77%~64.63%，而DNA-P、Lipid-P和Protein+Residue-P僅分別為污泥TP含量的5.03%~11.91%、1.42%~3.38%和0.69%~2.76%.Poly-P包括LMW Poly-P和HMW Poly-P兩種形態(tài)，LMW Poly-P為污泥TP含量的10.87%~32.85%，HMW Poly-P為污泥TP含量的19.75%~36.39%.SRT為10 d時，低DO污泥的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量(以SS計)分別為8.79~10.17、2.36~5.36和4.53~7.33 mg · g-1，中DO污泥的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量分別為4.68~6.58、5.47~11.78和6.36~11.39 mg · g-1.SRT為30 d時，低DO污泥的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量分別為8.90~10.65、3.55~6.90和9.49~13.51 mg · g-1，中DO污泥的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量分別為13.94~16.06、5.41~10.00和9.15~13.97 mg · g-1.上述結(jié)果說明，高SRT(30 d)污泥的磷含量明顯高于中SRT(10 d)污泥，主要源于前者較后者有更高的PO3-4-P和HMW Poly-P含量，表明高SRT污泥結(jié)合磷的性能大于中SRT污泥.中SRT(10 d)下中DO污泥較低DO污泥有更高的磷含量，主要歸因于前者較后者有更高的LMW Poly-P和HMW Poly-P含量;而在高SRT(30 d)下中DO污泥較低DO污泥有更高的磷含量，主要歸因于前者較后者有更高的PO3-4-P和LMW Poly-P含量.可以推斷，污泥絮體中磷酸鹽的形成同生化反應(yīng)條件及生物誘導(dǎo)下的化學(xué)沉淀和吸附/結(jié)合作用有密切聯(lián)系.

　　圖 3 不同SRT和DO條件下污泥絮體中各形態(tài)磷含量

　　3.3 SRT和DO對EPS磷形態(tài)的影響

　　由表 2可以看出，SRT和DO對胞內(nèi)磷含量(單位質(zhì)量SS中細(xì)菌細(xì)胞磷含量)影響較小，而對EPS磷含量(單位質(zhì)量SS中EPS磷含量)影響較大.不同SRT和DO條件下，胞內(nèi)磷含量為7.02~12.30 mg · g-1，而EPS磷含量為14.66~31.10 mg · g-1.結(jié)合表 1可知，胞內(nèi)磷含量占污泥TP含量的27.07%~32.38%，EPS磷含量占污泥TP含量的67.62%~72.93%，說明EPS結(jié)合了大量的磷，污泥絮體中的磷主要分布于EPS中.

　　表2 不同SRT和DO條件下污泥絮體的磷分布

　　EPS中不僅含有PO3-4-P，而且含有Poly-P和有機磷.由表 3可以看出，EPS中的磷主要以PO3-4-P和Poly-P的形態(tài)存在，分別為EPS磷含量的10.93%~44.26%和34.69%~69.02%，其中，LMW Poly-P和HMW Poly-P分別為EPS磷含量的11.78%~37.34%和22.91%~41.17%，而DNA-P、Lipid-P和Protein+Residue-P僅分別為EPS磷含量的2.79%~7.95%、0.56%~2.84%和0.05%~0.72%.SRT為10 d時，低DO污泥EPS的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量分別為4.83~6.26、1.73~4.21和3.36~5.44 mg · g-1，中DO污泥EPS的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量分別為2.34~4.46、4.37~9.70和4.05~8.23 mg · g-1.SRT為30 d時，低DO污泥EPS的PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P含量分別為5.77~7.44、2.73~5.22和7.78~10.91 mg · g-1，中DO污泥EPS的PO3-4-P、LMW Poly-P含量和HMW Poly-P含量分別為9.82~10.90、4.16~7.34和6.90~10.66 mg · g-1.上述結(jié)果說明，高SRT(30 d)污泥的EPS磷含量明顯高于中SRT(10 d)污泥，主要歸因于前者較后者有更高的PO3-4-P和HMW Poly-P含量.這是因為SRT越大，PAOs的種群競爭優(yōu)勢越明顯，并且PAOs具有產(chǎn)生EPS的基因簇，所產(chǎn)生EPS含有更多的磷.中SRT(10 d)下中DO污泥的EPS較低DO污泥的EPS有更高的磷含量，主要歸因于前者較后者更高的LMW Poly-P和HMW Poly-P含量;而在高SRT(30 d)下中DO污泥的EPS較低DO污泥的EPS有更高的磷含量，主要歸因于前者較后者有更高的PO3-4-P和LMW Poly-P含量.生物強化除磷系統(tǒng)運行參數(shù)的短暫改變不會引起微生物主要種群結(jié)構(gòu)的變化，但會改變微生物的代謝方式，因而不同DO條件下EPS磷酸鹽含量和形態(tài)的差異說明EPS磷酸鹽的形成受到微生物代謝活動的影響，進(jìn)一步證明了EPS參與了生物聚磷過程.

　　表3 不同SRT和DO條件下EPS中各形態(tài)磷含量

　　3.4 反應(yīng)過程中EPS磷酸鹽含量的變化

　　厭氧/好氧反應(yīng)過程中，EPS中的PO3-4-P與LMW Poly-P、HMW Poly-P表現(xiàn)出不同的變化趨勢(圖 4和圖 5).不同SRT和DO條件下，EPS中的PO3-4-P含量(以SS計)在厭氧初期0~0.5 h迅速下降，此后無明顯變化規(guī)律.SRT為10 d時，EPS的PO3-4-P在低DO和中DO條件下的厭氧降低量分別為1.24 mg · g-1和2.12 mg · g-1，好氧反應(yīng)階段分別降低了0.20 mg · g-1和升高了0.50 mg · g-1.SRT為30 d時，EPS的PO3-4-P在低DO和中DO條件下的厭氧降低量分別為0.47 mg · g-1和0.17 mg · g-1，好氧反應(yīng)階段分別降低了1.20 mg · g-1和0.91 mg · g-1.

　　圖 4 圖 4 1#反應(yīng)器污泥EPS中不同形態(tài)磷酸鹽含量的變化

　　圖 5 2#反應(yīng)器污泥EPS中不同形態(tài)磷酸鹽含量的變化

　　由圖 4可知，EPS中LMW Poly-P和HMW Poly-P含量呈現(xiàn)出明顯的厭氧降低和好氧升高的變化趨勢.SRT為10 d時，低DO條件下EPS的LMW Poly-P和HMW Poly-P含量在厭氧初期降低較緩慢，0~0.5 h分別降低了0.01 mg · g-1和0.61 mg · g-1，中DO條件下兩者在厭氧初期的降低量增大，0~0.5 h分別降低了0.52 mg · g-1和2.06 mg · g-1;低DO條件下其LMW Poly-P和HMW Poly-P含量在好氧初期快速升高，4~5 h分別升高了0.56 mg · g-1和1.16 mg · g-1，中DO條件下兩者在4~5 h分別升高了1.81 mg · g -1和1.14 mg · g-1.SRT為30 d時，EPS的LMW Poly-P含量在低DO和中DO條件下均表現(xiàn)為厭氧初期快速降低，0~1 h分別降低了0.97 mg · g-1和1.55 mg · g-1，好氧初期迅速升高，4~5 h分別升高了0.72 mg · g-1和1.10 mg · g-1;其HMW Poly-P在低DO和中DO條件下較LMW Poly-P表現(xiàn)為厭氧初期緩慢降低，0~1 h分別降低了0.59 mg · g-1和0.88 mg · g-1，好氧初期亦迅速升高，4~5 h分別升高了0.97 mg · g-1和0.76 mg · g-1.上述結(jié)果說明，中SRT(10 d)污泥EPS和高SRT(30 d)污泥EPS的Poly-P在厭氧初期的分解分別主要源自HMW Poly-P和LMW Poly-P;低DO條件和中DO條件下好氧初期合成的EPS Poly-P分別主要為HMW Poly-P和LMW Poly-P.不同SRT和DO條件下EPS中LMW Poly-P和HMW Poly-P厭氧分解和好氧合成過程的差異，說明EPS磷酸鹽的形成與轉(zhuǎn)化同微生物代謝活性、代謝方式和種群結(jié)構(gòu)有密切聯(lián)系.

　　4 討論

　　4.1 EPS在生物除磷中的作用大小

　　生物除磷是細(xì)菌細(xì)胞和EPS共同作用的結(jié)果.由圖 6可以看出，污泥絮體的厭氧釋磷和好氧吸磷過程主要源自EPS磷含量的厭氧降低和好氧升高，EPS磷的厭氧降低量和好氧升高量為胞內(nèi)磷變化量的2.8~6.4倍.厭氧/好氧反應(yīng)過程中，中SRT(10 d)污泥EPS在低DO和中DO條件下的除磷量分別為2.83 mg · g-1和4.91 mg · g-1，分別占污泥絮體除磷量的71.65%和70.55%;高SRT(30 d)污泥EPS在低DO和中DO條件下的除磷量分別為2.94 mg · g-1和3.09 mg · g-1，分別占污泥絮體除磷量的71.71%和71.86%，說明EPS對生物除磷作用有重要影響.中SRT(10 d)污泥EPS磷的厭氧降低量和好氧升高量大于高SRT(30 d)污泥，且中DO污泥EPS磷的厭氧降低量和好氧升高量大于低DO污泥的EPS;與中SRT(10 d)污泥EPS相比，DO改變對高SRT(30 d)污泥EPS磷變化量的影響較小，進(jìn)而導(dǎo)致DO改變對高SRT(30 d)污泥系統(tǒng)的生物除磷效果影響較小.

　　圖 6 厭氧/好氧反應(yīng)過程胞內(nèi)磷和EPS磷的變化量

　　采用超聲波-樹脂法提取不同進(jìn)水C/P比A/O-SBR反應(yīng)器活性污泥的EPS，結(jié)果表明，EPS除磷量占系統(tǒng)除磷量的60%~62%，與本文研究結(jié)果接近.周健等和Li等采用陽離子交換樹脂法分別提取不同A/O-SBR反應(yīng)器活性污泥的EPS，前者認(rèn)為EPS的除磷量占系統(tǒng)除磷量的15.7%，后者認(rèn)為EPS的除磷量占系統(tǒng)除磷量的4.2%~13%，與本文研究結(jié)果差異較大.超聲波-樹脂法是高效的EPS提取方法，其低頻、低功率超聲波能有效分散污泥絮體，促進(jìn)后續(xù)離子交換反應(yīng)，具有化學(xué)污染小、細(xì)胞破損率低的優(yōu)點，且較陽離子交換樹脂法能更為高效地提取EPS.因此，相關(guān)研究結(jié)論存在明顯差異不僅與污泥樣品的來源有關(guān)，而且與EPS提取方法的不同有密切聯(lián)系.另一方面，EPS主要來源于微生物細(xì)菌的代謝分泌物和自溶產(chǎn)物，合成EPS是微生物細(xì)菌重要的生存、競爭策略;PAOs(包括反硝化聚磷菌)是一類具有超量攝磷功能的微生物，與其它微生物存在復(fù)雜的共生/互生關(guān)系，目前仍無法培養(yǎng)出PAOs的純菌群.可以推斷，PAOs與其它微生物通過EPS合成方式的改變建立共生/互生關(guān)系，促使EPS吸附/結(jié)合大量的磷，是PAOs超量釋磷/攝磷的重要途徑.

　　4.2 EPS磷酸鹽形態(tài)對生物除磷過程的影響

　　EPS磷酸鹽可分為PO3-4-P、LMW Poly-P和HMW Poly-P 3種形態(tài)，EPS磷酸鹽的形態(tài)對EPS除磷過程有重要影響.生物除磷過程中EPS的PO3-4-P含量變化涉及PO3-4-P和Poly-P之間的轉(zhuǎn)化及主體液相與EPS之間PO3-4-P的遷移兩方面.由圖 4和圖 5可知，相對于11 h污泥的EPS，0 h時污泥EPS的PO3-4-P含量均較高，而LMW Poly-P和HMW Poly-P含量均較低，可以推斷，沉淀過程中EPS的Poly-P發(fā)生了分解，并以PO3-4-P的形式滯留于EPS中;厭氧初期，在攪拌混合作用下沉淀過程滯留于EPS的PO3-4-P迅速遷移至主體液相，導(dǎo)致EPS的PO3-4-P含量在0~0.5 h迅速降低，這是厭氧初期污泥絮體快速釋磷的重要原因之一;此后，EPS的PO3-4-P含量無明顯變化規(guī)律，主要因為PO3-4-P和Poly-P之間的轉(zhuǎn)化速率及主體液相與EPS之間PO3-4-P的遷移速率在反應(yīng)過程中發(fā)生了動態(tài)變化.EPS的LMW Poly-P和HMW Poly-P含量均表現(xiàn)厭氧降低和好氧升高的變化規(guī)律.由圖 7可知，對于相同SRT的污泥，中DO條件較低DO條件下EPS的LMW Poly-P和HMW Poly-P有更大的厭氧降低量和好氧升高量，對應(yīng)著更明顯的生物除磷過程(圖 2).高SRT(30 d)污泥EPS的Poly-P(LMW Poly-P和HMW Poly-P)在中DO條件的好氧升高量為低DO條件的1.2倍，而中SRT(10 d)污泥EPS的Poly-P在中DO條件的好氧升高量為低DO條件的2.1倍，從而表現(xiàn)出DO濃度的變化對高SRT(30 d)污泥系統(tǒng)的生物除磷過程及效果影響較小的現(xiàn)象.厭氧/好氧反應(yīng)過程中，EPS不同形態(tài)磷酸鹽含量的動態(tài)變化說明EPS不僅是生物除磷過程的中轉(zhuǎn)站，而且參與了生物聚磷過程.

　　圖 7 厭氧/好氧反應(yīng)過程EPS中不同形態(tài)Poly-P的變化量

　　5 結(jié)論

　　1)污泥絮體中的磷主要分布于EPS中，PO3-4-P和Poly-P(包括LMW Poly-P和HMW Poly-P)是EPS磷的主要形態(tài).高SRT(30 d)污泥的EPS磷含量明顯高于中SRT(10 d)污泥，主要歸因于前者較后者有更高的PO3-4-P和HMW Poly-P含量;厭氧/好氧反應(yīng)過程中，EPS的PO3-4-P與LMW Poly-P、HMW Poly-P表現(xiàn)出不同的變化趨勢.

　　2)EPS對生物除磷的影響明顯大于細(xì)菌細(xì)胞.污泥絮體的厭氧釋磷和好氧吸磷過程主要源自EPS磷含量的厭氧降低和好氧升高，EPS磷的厭氧降低量和好氧升高量為胞內(nèi)磷變化量的2.8~6.4倍.

　　3)EPS不僅是生物除磷過程的中轉(zhuǎn)站，而且參與了生物聚磷過程.EPS的LMW Poly-P和HMW Poly-P含量均表現(xiàn)厭氧降低和好氧升高的變化規(guī)律;對于相同SRT的污泥，中DO(2.5~3.5 mg · L-1)條件較低DO(0.7~1.0 mg · L-1)條件下EPS的LMW Poly-P和HMW Poly-P有更大的厭氧降低量和好氧升高量，對應(yīng)著更明顯的生物除磷過程.

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